流式细胞术是最早在上世纪50年代确立的一项用于对单个细胞表型浮松和功能分析的器具自慰 偷拍,不错从异质型群体中找到单个细胞的特有特征。如今大火的单细胞测序,多些许少是鉴戒了流式细胞术的想象理念。使用流式细胞术,征询者们不错测量细胞的大小,内容物颗粒度,判定细胞的生死景色,细胞周期以及卵白的抒发情况,现如今是一种十分经典的免疫学征询器具。
荧光旨趣
在征询中使用的荧光素包括荧光卵白(藻红卵白PE,别藻蓝卵白APC等),也包括一些合成荧光物资(Spark系列荧光素)。这些荧光物资都不错接收特定波长的光源,然后辐射出波长更长的光信号。如下图所示,每一种荧光素都有特有的接收光谱和辐射光谱;
图1.Spark Blue™️ 550的接收光谱和辐射光谱
在荧光素接收和辐射光的经过中,实质上是荧光素的电子接收了光子的能量,接收的能量又必须开释使得电子回到基态。在能量开释的经过中,部分能量以热能的形貌被销耗,这么就使得开释的光子能量比被接收的光子能量要低,是以开释出的光的波长更长,能量更低。其铁心即是开释出的能量的“神态”会不不异。其暗意图如下图所示:
图2. Jablonski 暗意图
荧光素的最大接收波长和最大辐射波长之间红移,称为斯托克斯位移,如图1所示。那些具有更大斯托克斯位移的荧光素常具有更小的配景荧光,在多色流式panel想象中每每具有更好的适用性。
偶联荧光素每每具有很大的斯托克斯位移,它们由两种共价合并的荧光素构成,一种称为供体一种称为受体,父女乱伦文学由供体的辐射光,通过荧光能量共振转机(fluorescenceresonance energy transfer,FERT)模子,成为了受体的引发光,从而引发了受体荧光素的新荧光。
如下图所示,PE-Cy5是一种由PE和Cy5构成的偶联荧光素,其引发光谱和PE有很大部分的重复,而辐射光谱险些和Cy5一致:
是以,将偶联荧光素应用到流式细胞术中,不错使用单一的激光,引发出多种不同辐射波长的荧光,比如常见的561nm激光器,不错引发出PE-Cy7,PE-Cy5,PE/Fire™ 700,PE/Fire™ 640 , PE/Fire™ 810等一系列由PE及相应受体构成的偶联荧光素,他们的辐射波长界限从600+nm一直散布到800+nm波长的远红外段,大地面拓展了流式细胞术一次践诺中不错检测的持续数目。
丝袜xxx亮度
荧光亮度,不错通过摩尔消光统统和量子产率来形色,前者指的是光在特定波长下被接收的些许,后者指的是辐射的光子数目和接收的光子数目之比。抗体的荧光亮度受多种身分影响,其中之一即是荧光素/抗体比例(fluorophore:protein(F:P) ratio)。F:P 值和荧光素大小以及荧光记号技艺干系,频繁小分子的荧光素不错更多地合并到抗体上。另外,被记号的细胞荧光的强弱,和该细胞上相应抗原的抒发强度干系,抒发品貌越高,更多的抗体不错合并到细胞上,细胞更“亮”,如下图所示:
影响流式抗体“亮度”的身分还包括抗体亲和力,仪器激光器的引发波长,激光器铁心等,为了长入“度量衡”,咱们在厂内使用不同荧光素,一都去偶联换取克隆的CD4抗体,然后用换取浓度的抗体对PBMC样品进行细胞记号,终末在流式细胞仪上蚁合对应的荧光信号。通过揣度打算并比拟多样荧光素的SI值(stain index, 揣度打算技艺如下图所示):
这么就不错知说念某一种荧光素的“亮度”。咱们测试了通盘BioLegend在售的荧光素的亮度,何况按照强弱,从1到5的相对亮度进行排序,1代表荧光素‘亮度‘较弱,5代表荧光素’亮度‘很强,在进行流式panel design的时期就不错诳骗这么的强弱来搭配不同的检测持续。
本期先到这里啦!敬请期待下一期。
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